АНЕСТЕЗИОЛОГАМ ОБ ОКСИДАЗНОМ СТРЕССЕ, АПОПТОЗЕ И НЕЙРОТРАНСМИССИИ

М.Лэйми, Д. Деби Дюпон (Льеж, Бельгия)

Введение

Нейротрансмиссия и апоптоз, а также роль оксидазного  стресса становятся яснее, но много вопросов остаются не понятными до конца, и прежде всего, «оксидазный стресс». Мы представляем обзор современных достижений в области нейротрансмиссии и механизмов апоптоза, а также роли активных радикалов кислорода (АРК).

Основные механизмы нейротрансмиссии и апоптоза

Передача сигнала информации зависит от наличия испускающей сигнал клетки и воспринимающей клетки (рис.1). Передача информации может осуществляться в виде электрического сигнала, химических молекул, межклеточных соединений в виде контактных ворот, взаимодействий поверхностных лигандов и рецепторов и т.д. (1).

 

Рисунок 1. Схема передачи информации от внешних источников сигнала до клетки мишени. Есть два основных пути получения информации от внешних источников: посредством рецептора (стимуляция 1) и сигнал Н, проходящий в клетку путем диффузии (стимуляция 2) (детализация – в тексте). RP – цитоплазматический или ядерный рецептор; EP – эффекторные белки; AP – воспринимающие белки; E – ферментный каскад; NF – ядерные факторы. 

 

Клеточная обработка стимулов включает в себя синтез внешнего сигнала, перенос этой информации до клетки-мишени, его непосредственную обработку этой клеткой путем биотрансформации химических реакций на протяжении от рецептора до завершения клеточной реакции на полученный сигнал. Все эти этапы тщательно контролируются, а клетка, испускающая сигнал, четко зависима от регулирующих ее состояние метаболизма, повторения информации, ее диференцировки и апоптоза воспринимающей клетки.

Описано два варианта входа внешнего сигнала в воспринимающую клетку: пассивная диффузия и рецепторное связывание. При пассивной диффузии посредник (Н – чаще всего гормоны) связывается с цитоплазматическими или ядерными рецепторами (рис.1, путь стимуляции 2). Если внеклеточный посредник не диффундирует в клетку-мишень, то происходит его взаимодействие с рецепторами наружной мембраны клетки (рис.1, путь стимуляции 1), в том числе и модифицирующими рецепторами (чаще – путем олигомеризации). Затем сигнал переносится внутрь клетки при участии трансмембранной части рецептора и/или белков, сцепленных с цитоплазматической частью рецептора (ЧР), и работающих по типу «включателя» при дальнейшей передаче сигнала. Внутри клетки наступает каскадный механизм обработки информации, проходящей через эффекторные (EP) и воспринимающие белки (AP), второго посредника и ферментативный каскад (E). При этом в цитоплазматическом комплексе вырабатываются ядерные факторы (NF) и ингибиторы вслед за транслокацией ЯФ в ядро, где они связываются с соответствующим участком ДНК, запуская процесс транскрипции специфических генов. Финальный результат  проявляется в виде активации клеточных белков, запускающих  многообразные реакции: иммунные, воспалительные, а также реакцию программированной гибели клетки, известную как «апоптоз» (1,2). Очень много неясности в механизмах механической ориентации клетки, выражающейся в избирательной активации генов или апоптозе, но благодаря последним сведениям стало известно, что участие некоторых ядерных факторов более специфично при апоптозе, чем других.

Внутриклеточные компоненты каскадной обработки сигнала

Компонентами внутримолекулярной обработки и передачи сигнала являются белки или небольшие молекулы, часто называемые посредниками второго вестника (циклические нуклеотиды, трифосфат инозитола и ионы Са++), которые активируются и запускают соответствующие ферменты передачи сигнала. Белки, которые участвуют в таких процессах, обычно являются гормонами, эффекторные белки (чаще – связанные с клеточной мембраной) являются запускающими в процессе передачи сигнала и AP, которые в основном несут связующую роль между исключительными компонентами передачи сигнала. Эти AP являются также и местом гибели или нейтрализации многих переносящих информацию элементов.

Краеугольным камнем регуляции процесса передачи информации является процесс фосфорилирования и протеолиза. Фосфорилирование осуществляется на серин/треониновом или тирозиновом окончании за счет протеинкиназ, что создает возможность появления новых точек связывания белка. Фосфорилирование белков регулируется дефосфориляцией белковыми фосфатазами (2,3).

Протеолиз вмешивается в процессы зарождения новых белков (активация проферментов путем ограниченного протеолиза) и их деградации. Образование протеасом – основной путь протеолиза в процессе передачи сигнала. Протеасомы представляют собой крупные многобелковые комплексы, которые разрушаются путем вездесущего фосфорилирования. Роль протеасом хорошо описана в реакциях деградации комплексов, сформированных за счет NF и их ингибиторов (4).

Ядерные факторы

Ядерные факторы присутствуют в цитоплазме в виде неактивных форм, сцепленных со специфическими ингибиторами. Фосфорилирование – основной механизм, контролирующий их активность. Их выброс мониторируется путем оксиметрии в луковице яремной вены; оксигенация ткани головного мозга (РО2) ингибирует и регулирует их транспорт в ядро клетки. После димеризации они связываются со специфическими элементами ДНК и действуют как активаторы или репрессоры процесса считывания информации в комплексе с другими регуляторными белками. Семейство ядерных факторов состоит из ЯФ-кВ/Rel факторов транскрипции и представляет собой пять различных, связанных с элементами ДНК, субъединиц: ЯФ-кВ1/Rel (р50), ЯФ-кВ2/Rel (р100/р52), Rel А (р65), Rel В и с-Rel (5). У родственных образований присутствует гомологичный домен из ± 300 аминокислот, ответственных за связывание с IkB протеином, димеризацию и связывание с аминокислотами. Они также сплетаются в гомологичные или гетерологичные димеры, сосредоточенные в цитозоле в виде неактивных форм и связанных с молекулами-ингибиторами семейства IkB. Одним из представителей этого ряда является гетерологичный димер р50:р65 (Rel A), обозначаемый как ЯФ-kB. Это уникальный фактор в силу его быстрой активации и регуляторной способности. Он играет главную роль в воспалительном и иммунном ответе, когда необходима быстрая активация гена для сохранения жизни клетки (продукция цитокинов и протеинов острой фазы). В большинстве типов клеток этот механизм препятствует апоптозу. ЯФ-кВ активируется основными стимуляторами (провоспалительными цитокинами, бактериями, ЛПСД, вирусами…), а также реактивными продуктами распада кислорода, которые образуются в ходе воспалительной реакции. Его активация начинается с процесса фосфорилирования на двух сериновых окончаниях IkB, активируемого специальной IkB-киназой (IKK). Затем реакция распространяется на всю субстанцию, приводя к быстрой деградации IkB протеасомами (4). ЯФ-кВ вырабатывается и быстро транслоцируется в ядро. Регулирование активации ЯФ-кВ контролируется в основном интенсивностью и распространенностью реакции фосфорилирования IкВ, а также и степенью активности протеасом (рис.2).

Рисунок 2. Активация ядерного фактора ЯФ-кВ в цитоплазме и внутриядерная активность. р50 и р65 (Rel A): субъединицы ЯФ-кВ; IkB : ингибитор ЯФ-кВ; IKK: специализированная протеин киназа, которая связывает 2 фосфата (Р) на двух сериновых окончаниях IkB. Фосфорилирование сменяется распространением реакции и диссоциацией ЯФ-кВ-IkB комплекса, которая позволяет ЯФ-кВ войти в ядро и запустить процесс транскрипции ДНК.

 

Специфические аспекты апоптоза

Апоптоз (программируемая гибель клетки: ПГК; часто называется как самоубийство клетки) запускается естественными и патологическим факторами и характеризуется запрограммированной относительно медленной морфологической эволюцией клетки, для которой необходим синтез новых матричных РНК и новых протеинов (2,6). Апоптоз это необходимый процесс для развития и обновления тканей, поддержания иммунного гомеостаза за счет обновления популяций лимфоцитов и элиминации определенных для этого и поврежденных клеток или избыточного количества лимфоцитов после удаления антигенов.

Рисунок 3. Схематическое изображение процесса апоптоза клетки: конденсация ядерного вещества, сжатие и формирование изгибов клетки, фрагментация и выброс пузырьков (апоптических тел).

Апоптоз коренным образом отличается от некроза, который представляет собой острый процесс гибели клетки путем быстрого разрыва клеточной мембраны и дезинтеграции всей клетки. Апоптоз запускается состоянием ядерного материала, сжатием и обезвоживанием клетки, которые заканчиваются ее фрагментацией и выбросом пузырьков, апоптических тел. Последние захватываются фагоцитами без сопровождения воспалительной реакции (рис.3). Недостаточность или избыток апоптоза играет значительную роль в патогенезе таких заболеваний, как рак или аутоиммунные болезни, а также участвует при функциональных нарушениях, сопряженных с процессами ишемии-реперфузии (7). Апоптоз запускается специфическими сигналами и часто зависим от их передачи, но не всегда, так как в клетке уже присутствуют крупные части сигнальной субстанции в латентной форме, которые могут быть активированы простой стимуляцией.

Рисунок 4. Схематическое изображение каскада апоптоза, начинающегося с активации мембранного рецептора: цепочка запуска рецептора гибели клетки и активация «эшафота» ЦАП. Связанный с лигандом (Fas-L) и собственно тримерный рецептор Fas (CD95) взяты в качестве типичного примера трансмембранного рецептора. Он связывается посредством домена гибели клетки (DD) с ассоциируемым протеином (FADD), который представляет собой эффекторный домен гибели клетки (DED), и вовлекает в процесс инициатор проЦАП.

Ключевыми элементами апоптоза являются гибель имеющихся белков посредством протеолиза и реакция расщепления caspases (цистеин-аспартат протеаза, ЦАП), используемая в этом протеолизе (8,9,10). Эти ферменты (14 разных энзимов млекопитающих) присутствуют в неактивных формах (зимогены) и активируются (самостоятельно при участии ЦАП) с образованием энзимов-тетрамеров. Две группы ЦАП отличаются по структуре зимогенов: ЦАП инициатор и ЦАП эффектор, причем последний активируется предыдущим. Есть сообщения о существовании трех подгрупп ЦАП, активируемых исключительно при воспалении (ЦАП 1,4 и 5: подгруппа 1) или при апоптозе (ЦАП 3,6,7,8,9 и 10: подгруппы 2 и 3), однако такая классификация остается пока в стадии обсуждения. При апоптозе участвуют 2 каскада ЦАП: каскад, запускаемый при гибели рецепторов на поверхности мембраны, и каскад, инициируемый стрессовой альтерацией в митохондриях. Первый каскад инициируется при связывании погибшего сигнального участка с рецептором гибели на поверхности мембраны клетки (рис.4).

Такая цепочка связывания индуцирует олигомеризацию рецепторов, задействует внутриклеточные белки, которые связаны с рецепторами, формирующими комплекс, содержащий информацию (сигнал) о гибели клетки (DISC) и запускающий «эшафотную активацию» каскадной цепочки ЦАП, начиная с ЦАП-8. Вторая каскадная цепочка начинается со стимуляции (обычно присутствующей при стрессе), которая не приводит к связыванию рецепторов, но заставляет митохондрии выбрасывать цитохромы (рис.5).

Рисунок 5. Митохондриальный путь апоптоза: стрессовая стимуляция нарушает триггерный выброс митохондриями цитохрома С (Cyt c). С этого момента апоптоз развивается механически. Цитохром С формирует комплекс со специальным белком Apaf-1, связываясь при этом с АТФ и вовлекая проЦАП-9.

 

Проапоптозные и антиапоптозные агенты подгруппы Bсl-2 регулируют выработку цитохрома С. В цитоплазме цитохром С формирует комплекс с цитоплазматическими факторами и специальным белком Apaf-1, который связывается и гидролизирует АТФ. Цитохром С-Apaf-1 комплекс вовлекает, связывает и активирует ЦАП-9 (восходящий каскад), который в последующем активирует ЦАП-3,6 и 7 (нисходящий каскад).

На различных уровнях каскадной цепочки апоптоза действуют различные механизмы регуляции, но процессами регуляции активации каскада являются фосфорилирование и дефосфорилирование протеинкиназами и фосфатазами.

 

Роль реактивных радикалов кислорода в передаче сигнальной информации при апоптозе

Подпись:

Реактивные радикалы, образующиеся из кислорода (РРК) и из соединения азота с кислородом (РРАК), играют критическую роль в механизме воспаления при септицемии и респираторном дистресс синдроме. РРАК являются мощными противомикробными агентами, заставляющими микроорганизмы разрушаться до фаголизосом, но они также являются и повреждающими агентами близлежащих клеток и тканей, так как вырабатываются бесконтрольно стимулируемыми фагоцитами на фоне острой воспалительной реакции. За их продукцию и разрушение ответственны специфические ферменты, которые могут быть идентифицированы и характеризованы (рис.6)

Рисунок 6. РРАК каскад, начинающийся с супероксид аниона (О2-) и оксида азота (.NO), запускается соответствующими ферментами. Образуется пероксинитрит (ONOO-), нестабильное вещество, реагирующее со многими биомолекулами (особенно с –SH группами (NO2- - нитрил-радикал и ОН-гидроксил-радикал) или с нитрониум ионом (NO2+), ответственными за процессы нитрирования и гидроксилирования. Перекись водорода (Н2О2) образуется из радикала кислорода (О2-  ); при наличии комплексиона железа (+L-Fe2+ ) из перекиси водорода образуется гидроксильный радикал (.ОН), а в полиморфноядерных фагоцитах при участии миелопероксидазы (MPO), перекиси водорода и хлорид аниона (Cl- ) образуется солянистая кислота (HOCl), которая ответственна за окисление клеточных структур. Она реагирует с нитритом (NO2-, который образуется в результате реакции радикала NO и молекулярного кислорода О2 ) и пероксинитритом (ONOO-), в результате чего образуется нестабильный нитрил хлорид (NO2Cl), распадающийся на NO2 . -радикал и чистый хлорид).

РРАК могут присутствовать во многих типах клеток (лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы…) и их образование является основным  in vivo феноменом, который точно регулируется и обуславливает нормальный клеточный метаболизм. Основными эндогенными источниками РРАК являются продукты активации реакций с участием таких ферментов, как НАДФ-оксидаза, NO-синтетаза, ксантин-оксидаза, цепочка транспорта электронов в митохондрии, метаболизм арахидоновой кислоты и активность цитохрома Р450. В норме однако РРАК образуется немного. В 1973 году было определено, что в нормальных условиях митохондриями расходуется ±2% кислорода на построение супероксид иона (О2- ) и его продукта дисмутации – перекиси водорода. Это наблюдение имело важное значение для продолжения исследований по передаче сигнальной информации в клетке (11).

Оксидазный стресс и окислительно-восстановительный баланс

Состояние компонентов окисления-восстановления (Е0) определяется возможностью захвата (окислительный компонент) или выброса (восстановительный компонент) одного или более электронов. Для нормальной биологической среды характерно наличие равновесия между оксидантами и восстановителями (РОВ). Несмотря на определенные трудности в точном измерении этого РОВ, цитоплазма в физиологическом состоянии представляется более основной средой за счет присутствия в ней глутатиона (ГТИ), НАД/НАДФ, особенно в лейкоцитах (рис.7).

 Нарушение РОВ внутри клетки немедленно влечет за собой запуск механизмов переноса сигнальной информации и главная роль в этом принадлежит функции –SH групп. Функциональная активность тиоловых групп зависит от множества компонентов, участвующих в процессе переноса сигнальной информации: клеточных рецепторов, ЦАП, ядерных факторов и даже ядерных белков, которые регулируют связывание  ЯФ с элементами ДНК. Функции –SН групп легко нарушаются в результате окислительных реакций и являются идеальной мишенью РРАК. Физиологическая роль РРК заключается в изменении РОВ за счет потребления основных молекул (ГТИ, НАД, НАДФ) или в результате оксидазной модификации структуры белков. Окислительное повреждение белков позволяет последним взаимодействовать с рецепторами, изменять истинную ферментную активность или связываться со специфическими мишенями на ДНК, запуская, таким образом, перенос сигнальной информации и генные проявления. В лейкоцитах нарушения РОВ можно представить изменением переноса сигнальной информации.

 В физиологических условиях баланс ферментных и неферментных антиоксидантов создает РОВ, задерживая окислительные и восстановительные изменения внутри клетки. Этот баланс нарушается избыточной активацией НАДФ-оксидазы в стимулированных лейкоцитах. In vivo избыточная продукция реактивных радикалов кислорода и азота возможна при воспалении, для которого характерна интенсивная активация лейкоцитов, или при таких необычных ситуациях, как массивная радиация. В таких случаях, когда буферная емкость антиоксидантов становится избыточной или патологически снижается, возможны оксидазные повреждения с развитием оксидазного стресса.

Участие РРАК в переносе сигнальной информации и апоптозе

В 1991 году реактивные радикалы кислорода были определены как активные агенты активации ядерных факторов передачи информации подгруппы ЯФ-kB/Rel (12). Благодаря этим первым наблюдениям накоплены доказательства того, что РРК играют роль внутриклеточных факторов посредников в регуляции переноса сигнальной информации и апоптоза (11,13,14). Для этого необходимы специальные условия: небольшой объем, высокая диффузионная способность, равномерность воздействия, быстрый синтез и разрушение. РРК удовлетворяют всем этим условиям, но они высоко токсичны в силу окислительных свойств, поэтому только в низких концентрациях РРК можно считать физиологическими внутриклеточными посредниками переноса информации, а также следует четко различать оксидазный стресс и изменение РОВ при появлении «физиологических доз» РРАК. В большинстве исследований уделяется внимание роли РРК в цепочке переноса сигнальной информации при участии перекиси водорода в концентрации 3 х 10-4 М, которая необычно высокая для ситуаций in vivo, за исключением внутриклеточной среды активированных фагоцитов (или родственных клеток).

Подпись:

Рисунок 7. РОВ в цитоплазме. В норме цитоплазма находится в несколько основном состоянии; внешний сигнал может стимулировать продукцию физиологических концентраций РРАК, приводя к небольшому снижению содержания оснований в цитоплазме, что запускает перенос сигнальной информации. В патологических условиях (избыточная внешняя стимуляция, бесконтрольная активность фагоцитов) РОВ смещается в сторону оксидазной активности, при этом концентрация восстановительных агентов (в основном –SH функция) и активность антиоксидантных ферментов значительно падает.

В большинстве публикаций сообщается об активации ЯФ-кВ РРК, в основном перекисью водорода, но и другие ядерные факторы транскрипции информации и некоторые каскады протеинкиназ чувствительны к РРК. Наиболее частой мишенью для РРК в протеинкиназах и передающих сигнальную информацию белках является регуляторный домен, который в норме активируется фосфорилированием. Другой мишенью РРК многих белков и ферментов, участвующих в переносе информации, является глутатион и функция тиоловых групп. В клеточной культуре РРК вызывают окислительную инактивацию ЦАП (окисление –SH групп), апоптоз или некроз в зависимости от их концентрации и типа клетки (15). Факторы транскрипции, чувствительные к РОВ, такие как гипоксией индуцируемый фактор-1а (ГИФ-1а) и ЯФ-кВ, четко зависят от уровня ГТИ. В лейкоцитах вырабатывается физиологическое количество перекиси водорода при воздействии цитокинов, таким образом ее можно считать физиологическим вторичным посредником передачи информации.

Однако точные механизмы активации РРК процесса передачи сигнальной информации остаются в большинстве случаев необъяснимыми. Было также показано, что РРК индуцируют фосфорилирование тирозина в лимфоидных клетках. Так как уровень фосфорилирования тирозина является результатом баланса двух процессов: фосфорилирования протеин тирозин киназами и дефосфорилирования протеин тирозин фосфатазами (ПТФ), то очевидно, что наилучший эффект РРК на фосфорилирование тирозина может быть достигнут при активации киназ или ингибиции фосфатаз. Продукты окисления липидов (окисленный LDL, окисленные формы холестерола и липоальдегиды, например 4-гидроксиноленол) также влияют на процессы регуляции генного проявления в виде адгезии молекул, появления протеинов при тепловом ударе, цитокинов, факторов роста… (16). В любом случае их механизм действия, роль РРК подтверждены использованием компонентов антиоксидантов (N-ацетил-цистеин) и ферментов (каталаза), которые ингибируют перенос сигнальной информации, в основном, за счет угнетения фосфорилирования тирозина. Тем не менее, до сих пор тестируется и оценивается участие РРК в процессе переноса сигнальной информации. В недавних исследованиях на эндотелиальных клетках было показано, что перекись водорода индуцирует появление активности связывания ДНК с ЯФ-кВ, но результатом этого является «молчание» считывания информации (17). Остаются проблемы в оценке роли РРК/РРАК в апоптозе. В результате оксидазного стресса, вызванного перекисью водорода, клетка может разрушиться путем апоптоза или некроза в зависимости от концентрации перекиси водорода: в дозе 3 х 1 мМ (оксидазный стресс) клетка претерпевает некротические изменения, а в микромолярных концентрациях – апоптоз. Различие в эволюционных изменениях будет зависить от уровня АТФ (18).

Практическая роль NO и пероксинитрита: играет ли пероксинитрит ключевую роль в повреждении процесса переноса сигнальной информации?

NO является прототипом молекулы, участвующей в модификации РОВ и цепочке передачи сигнальной информации. NO и его производные (см. рис.6), по-видимому, регулируют перенос сигнальной информации в специфическом направлении в зависимости от типа клетки, характера стимуляции, концентрации NO и состояния РОВ клетки. В результате активации NO-синтетазы и переноса сигнальной информации, связанной со стрессовой стимуляцией протеинкиназ, изменяется кровоток в эндотелиальной ткани (стрессовый синдром «ножниц») (19). NO также будет влиять на процесс активации ЦАП и регуляции генной экспрессии путем S-нитрозилизации/S-денитрозилизации (20) и станет влиятельным фактором в митохондриальном пути апоптоза (21). Однако в последние годы увеличивается число исследований пероксинитрита (ONOO-), нестабильного продукта окисления NO с супероксидионом (см.рис.6), как главного компонента регуляции процесса переноса сигнальной информации при повреждении рецепторов или как участника переноса информации во многих внутриклеточных местах (22). Путем нитрирования уменьшается количество истинного тирозина, ONOO- способен повреждать ферменты, участвующие в процессе переноса информации, такие как тирозинкиназа (рис.8).

Нитрированные протеины таким образом станут не только функционально неактивными за счет действия ONOO-, но и активными веществами, поддерживающими процесс заболевания. Киназы тирозина сами по себе должны быть фосфорилированы, чтобы в соответствующем тирозиновом участке проявлять активность в процессе передачи сигнальной информации. В последующем, когда они дефосфорилируются, перенос информации прекращается. Ферменты, участвующие в дефосфорилировании, также являются тирозин-ответственными энзимами. Остатки нитрирования тирозина могут нарушать функции энзимов путем торможения фосфорилирования киназ тирозина и путем инактивации дефосфорилирующих ферментов. Пероксинитрит, таким образом, способен выступать в роли агента, нарушающего регуляцию апоптоза, блокирующего или усиливающего перенос информации, в зависимости от точки воздействия и типа энзима-мишени. Пероксинитрит также внедряется и в другие звенья цепочки апоптоза. Недавно сообщалось, что ONOO- принадлежит способность активировать переход проЦАП в ЦАП, исполнителей функции запуска апоптоза, который инициируется активацией рецепторов мембраны клетки. Было отмечено, что ONOO- активирует проЦАП-3 и 9. Пероксинитрит способен также повреждать фарторы транскрипции за счет разрушения их цистеиновых участков и путем окисления их основных железо-серных кластеров и пальчиковых цинковых компонентов. При этом теряется способность белков к связыванию с ДНК или к распознаванию соответствующих участков.

 

Рисунок 8. Возможные эффекты действия пероксинитрита (ONOO-) на цепочку переноса сигнальной информации. ONOO- путем окисления будет воздействовать на функцию –SH групп и за счет нитрирования белков, взаимодействующих с истинными протеинами (воспринимающими и эффекторными, АР и ЕР), ядерными факторами (ЯФ-кВ) и активного участия в процессах активации ферментов, участвующих в фосфорилировании (тирозин протеинкиназы, РК) и дефосфорилировании (фосфотирозин фосфатазы, ФТФ).

Влияние РРК на перенос сигнальной информации in vivo

Влияние РРАК и оксидазного стресса на перенос сигнальной информации in vivo плохо документировано. Действительно, трудно представить, что существует прямая кореляция между продукцией РРАК in vivo и активацией ядерных факторов. В настоящее время накапливаются непрямые доказательства того, что РРАК продуцируются in vivo в крови и легких. Эти данные получают путем оценки изменений состояния антиоксидантов (снижение концентрации витамина Е, активности антиоксидантных ферментов, общей емкости антиоксидантов в плазме,…) и определения оксидазных молекул (окисленные антипротеиназы, нитрированные протеины…) в жидкости после бронхо-альвеолярного лаважа у пациентов отделения интенсивной терапии (23,24). В большинстве клеток дыхательного тракта при остром поражении легких NO образуется при участии NO-синтетазы и супероксиданиона путем активизации НАДФ-оксидазы. Присутствие при этом активированных альвеолярных макрофагов и стимулированных захваченных нейтрофилов повышает продукцию РРАК. Это создает благоприятные условия для выработки продуктов РРК, нитритов, пероксинитрита, перекиси водорода, супероксидиона, НОСl.… В сочетании с цитокинами IL-1b и ТНФа РРАК регулируют чувствительный к РОВ процесс транскрипции ЯФ-кВ, который участвует в острой фазе многих иммунных и воспалительных реакций. В силу того, что этот фактор становится все более распознаваемым как анти-апоптозный фактор, значительная активация ЯФ-кВ в легких при РДСВ может повышать выживаемость провоспалительных нейтрофилов, поддерживающих воспалительный процесс в легких (25-27). При сепсисе была обнаружена усиленная активация ЯФ-кВ в моноцитах периферической крови. Этот показатель коррелировал с неблагоприятным исходом пациентов (28). У пациентов с РДСВ обнаружена повышенная активация ЯФ-кВ в альвеолярных макрофагах. У пациентов на искусственной вентиляции легких, но без РДСВ получены сходные результаты в острой стадии воспаления в легких (29). Недавно, исследуя жидкость после бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) у пациентов с вентилятор-ассоциированной пневмонией (ВАП), в нормальных альвеолоцитах мы обнаружили повышенную активность ЯФ-кВ. Таких данных мы не получили в группе пациентов на ИВЛ, но без ВАП и РДСВ. Как ожидалось, активность ЯФ-кВ коррелировала с концентрацией в жидкости БАЛ IL-1. Помимо этого повышенной оказалась концентрация IL-8, активной миелопероксидазы и количество нейтрофилов. Параллельно мы оценивали влияние РРК на активность ЯФ-кВ в альвеолоцитах, используя изолированную МПО продукты NO (нитриты и пероксинитрит). Было обнаружено, что последние в концентрации от 10-7 до 10-5 М активировали ЯФ-кВ в такой же степени, как и ТНФа, перекись водорода в концентрации 10-5  М и 10-5 М HOCl, - вещества, ранее называвшиеся активаторами ЯФ-кВ. Мы также обнаружили, что человеческая МПО в количестве 5 мкг также активна, как и ТНФа, и соответствует по активности реакции МПО in situ с перекисью водорода или продуктами NO, которые продуцируются альвеолоцитами.

Роль РРАК в активации переноса информации in vivo, таким образом, представляется значительной при нарушении РОВ. У пациентов в отделении интенсивной терапии (ОИТ) следует ожидать появления оксидазного стресса при избыточной стимуляции фагоцитов. Нобходимо разработать стратегию терапии, чтобы ограничить изменение РОВ как путем снижения активности фагоцитов (без иммуносупрессии), так и повышения антиоксидантного потенциала в крови и альвеолах. Дополнительные назначения в комплексе интенсивной терапии таких антиоксидантов, как витамин Е, молекул, богатых цистеином, веществ с присутствием следовых концентраций селена, ароматических аминокислот, благоприятны в такой же степени, как использование селективных антибиотиков, анестетиков, противовоспалительных препаратов… (30,31).

Заключение

Некоторые результаты влияния РРАК и оксидазного стресса на процесс переноса сигнальной информации и апоптоза ясны, но научные данные, в основном получаемые в лабораторных исследованиях на уровне клеток человека, вирусов и бактерий, быстро изменяются. Эти исследования очень необходимы и значительны, часто приводя к элегантным и простым концепциям, в которых возникают идеи прямого воздействия на регуляцию процессов переноса информации. Они начинаются со стимуляции и заканчиваются активацией генов или протеолизом. In vivo активация ЯФ-кВ альвеолярных макрофагов и снижение фагоцитарного апоптоза продемонстрирована при заболеваниях с острой фазой воспаления (сепсис, РДСВ). Но данные многообразны и их следует связывать с индивидуальными генетическими факторами. Очевидно, что простые схемы переноса информации в реальной жизни не применимы (32). Роль оксидазного стресса и РРАК в процессе переноса сигнальной информации и апоптоза остается далеко не полностью определенной, особенно в отношении «физиологических» концентраций специфических РРК.

Литература

1.       Krauss G.' Biochemistry of signal transduction and regulation. Wiley-VCH, Weinheim, 1999, 506 p. Recommended lecture for a complete view on signal transduction

2.       Rathmell JC, Thompson CB. The central effectors of cell death in the immune system. Annu Rev Immunol 1999; 17: 781-828.

3.       Hunter T. Protein kinase classification. Methods in Enzym 1991; 200: 3-37.

4.       Karin M, Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination; the control of NF-kB activity. Annu Rev Immunol 2000; 18: 621-63.

5.       Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-kB and Rel proteins: Evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 1998; 16: 225 – 60

6.       Kidd VJ. Proteolytic activities that mediate apoptosis. Annu. Rev. Physiol. 1998; 60: 533 – 73.

7.       Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of diseases. Science 1995; 267: 1456-62.

8.       Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, Luo X, Wang X. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol 1999; 15: 269-90.

9.       Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999; 68: 383-424. 10.

10.    Thornberry NA. Caspases: key mediators of apoptosis. Chem Biol 1998; 5: R97-R103

11.    Forman HJ, Cadenas E (eds) Oxidative stress and signal transduction. Chapman & Hall, New York, 1997, 475 p. Recommended lecture for a general view on the role of oxidative stress and signal transduction

12.    Schreck R, Rieber P, Baeuerle PA. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-l. EMBO J 1991; 10: 2247-58.

13.    Chandra J, Samali A, Orrenius S. Triggering and modulation of apopotosis by oxidative stress. Free Radic Biol Med 2000; 29: 323-33.

14.    Hensley K, Robinson KA, Gabbita SP, Salsman S, Floyd RA Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. Free Radic Biol Med 2000; 28: 1456 – 62.

15.    Warren MC, Bump EA, Medeiros D, Braunhut SJ. Oxidative stress-induced apoptosis of endothelial cells. Free Radic Biol Med 2000; 29: 537-47

16.    Leonarduzzi G, M C. Arkan, H Basaga, E Chiarpotto, A Sevanian, G Poli. Lipid oxidation products in cell signaling Free Radic Biol Med 2000; 28: 1370 – 8.

17.    True AL, Rahman A, Malik AB. Activation of NF-kB induced by H202 and TNF-a and its effects on ICAM-1 expression in endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000; 279: L302 – 11.

18.    Lelli JL Jr, Becks LL, Dabrowska MI, Hinshaw DB. ATP converts necrosis to apoptosis in oxidant-injured endothelial cells. Free Radic Biol Med, 1998; 25:. 694 – 702.

19.    Go YM, Patel RP, Maland MC, Park H, Beckman JS, Darley-Usmar VM, Jo H. Evidence for peroxynitrite as a signaling molecule in flow-dependent activation of c-Jun NH(2)-terminal kinase. Am J Physiol 1999; 277: H1647-53.

20.    Marshall HE, Merchant K. Stamler JS. Nitrosation and oxidation in the regulation of gene expression. FASEB J 2000; 14: 1889 – 900.

21.    Bosca L, Hortelano S. Mechanisms of nitric-oxide dependent apoptosis: involvement of mitochondrial mediators. Cell Signal 1999; 11: 239-44.

22.    Valdez LB, Alvarez S, Arnaiz LS, Sch pffer F, Carreras MC, Poderoso JJ, Boveris A. Reactions of peroxynitrite in the mitochondrial matrix. Free Radic Biol Med 2000; 29: 349-56

23.    Lamb NJ, Quinlan GJ, Westerman ST, Gutteridge JM, Evans TW. Nitration of proteins in bronchoalveolar lavage fluid from patients with acute respiratory distress syndrome receiving inhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: 1031-1034

24.    Mathy-Hartert M, Damas P, Nys M, Deby-Dupont G, Canivet JL, Ledoux D, Lamy M. Nitrated proteins in bronchoalveolar lavage fluid of patients at risk of ventilator-associated bronchopneumonia. Eur Respir J. 2000; 16: 296-301.

25.    Matute-Bello G, Liles WC, Radella F, Steinberg KP, Ruzinski JT, Jonas M, Chi EY, Hudson LD, Martin TR. Neutrophil apoptosis in the acute respiratory distress syndrome . Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: 1969-1977..

26.    Parsey MV, Kaneko D, Shenkar R, Abraham E. Neutrophil apoptosis in the lung after hemorrhage or endotoxemia: apoptosis and migration are independent of IL-lb. Clin Immunol 91: 219-225, 1999

27.    Matute-Bello G, Liles WC, Radella F2nd, Steinberg KP, Ruzinski JT, Hudson LD, Martin TR. Modulation of neutrophil apoptosis by granulocyte colony-stimulating factor during the course of acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med 2000; 28: 1-7

28.    Bohrer H, Qiu F, Zimmerman T, Zhang Y, Jllmer T, Mannel D, Bottiger BW, Stern DM, Waldherr R, Saeger HD, Ziegler R, Bierhaus A, Martin E, Nawroth PP. Role of NF-kB in the mortality of sepsis. J Clin Invest 1997; 156: 1969-1977.

29.    Schwartz MF, Moore EE, Moore FA et al. NF-kB is activated in alveolar macrophages from patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med 24: 1285-1292, 1996.

30.    Mouithys-Mickalad A, Hans P, Deby-Dupont G, Hoebeke M, Deby C, Lamy M. Propofol reacts with peroxynitrite to form a phenoxyl radical: demonstration by electron spin resonance. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 249: 833-837.

31.    Mathy-Hartert M, Mouithys-Mickalad A, Kohnen S, Deby-Dupont G, Lamy M, Hans P. Effects of propofol on endothelial cells subjected to a peroxynitrite donor (SIN-1). Anaesthesia. 2000; 55: 1066-1071.

32.    Lockshin RA, Osborne B, Zakeri Z. Cell death in the third millenium. Editorial. Cell Death Differ 2000; 7: 2-7.